大揭秘,耐U超高保真聚合酶的多领域应用!-技术前沿-资讯-生物在线

大揭秘,耐U超高保真聚合酶的多领域应用!

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-11-21T00:00 (访问量:8954)

 

DNA聚合酶是PCR反应的核心组分,广泛应用于生物及医学研究等领域。对于普通PCR,常规热稳定DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)即可满足需求。但对于高通量测序,扩增产物的准确性非常关键,优选高保真酶进行扩增。常规的高保真扩增酶无法读取和扩增含有尿嘧啶和次黄嘌呤的模板,翌圣生物通过定向改造,推出Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase,该聚合酶可兼容含U碱基模板和常规模板,扩增效率高保真性好,而且酶本身各项残留均很低,满足多种应用方向的扩增需求。

 

哪些应用方向可优选Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase呢?

 

 

重亚硫酸氢盐转化/酶法转化的DNA扩增-甲基化研究

  

DNA甲基化测序是研究生物体内基因调控的重要技术手段,越来越多地应用于肿瘤早筛、诊断等技术中。全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)是甲基化检测的金标准,在WGBS文库构建过程中,样本DNA经重亚硫酸氢盐处理后,非甲基化的胞嘧啶(C)会转化为尿嘧啶(U),甲基化的C则保持不变。在后续PCR扩增中U会转变为胸腺嘧啶(T),但常规高保真酶不能以含有dUTP的DNA作为扩增模板,因此需要经过特殊改造耐受dUTP的酶,从而应用到甲基化文库构建或者定点突变等技术中。

 

DNA甲基化建库常用到两种建库方法,甲基化单链建库和甲基化双链建库,单链建库技术主要针对BS转化处理后的单链及损伤DNA进行最大程度的利用和转化,步骤包括甲基化转化(使未甲基化的C转化为U)、变性(双链DNA变性为单链DNA)、3’接头连接、二链合成以及文库扩增。甲基化双链建库则通常是在DNA转化之前或之后进行文库构建,涉及连接甲基化接头、经亚硫酸氢盐或酶法转化处理,再经过一步扩增即可构建针对特定测序平台的甲基化文库。这两种建库的文库扩增都需要用到Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase。

受损FFPE DNA样本的扩增-肿瘤领域

  

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE) 的组织样本是世界各地病理实验室保存临床组织样本的标准方法。随着核酸测序技术的发展引起了人们对使用生物库中存储的历史FFPE样本的兴趣。然而,福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本在制备过程中会对DNA造成显著损伤,这些损伤包括:DNA分子链断裂,DNA高度片段化、核酸与蛋白质交联、胞嘧啶脱氨基,即FFPE样本中的胞嘧啶(C)可能脱氨基变成尿嘧啶(U)、氧化损伤、DNA的3'端被封闭、DNA-蛋白质交联。这些损伤会导致从FFPE样本中提取的DNA质量较差,从而影响下游应用,如PCR扩增、测序等。

 

为了解决这些问题,一种方法是采用修复试剂盒,如Hieff NGS® FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606),另一种方法是采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase对含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。

 

防止扩增子的气溶胶污染-病原领域

  

PCR技术使生命科学领域和研究手段发生了革命性的变化,与DNA克隆、DNA重组、DNA测序、RNA干扰等分子生物学技术一样,成为生物学和医学科学研究领域乃至临床疾病诊断不可缺少的工具。但是扩增产物的污染,是PCR反应中最主要的污染问题,因为PCR产物拷贝量大(一般为1013copies/ml),远远高于PCR检测拷贝的上限,所以极微量的PCR产物气溶胶,就可能造成假阳性。对于qPCR、RT-qPCR的扩增酶为Taq酶,Taq酶具有耐U的功能,常搭配UDG酶一起使用,Taq酶不具有高保真性,在一些需要保真度高的应用中Taq酶就无法胜任,如针对病原基因组的扩增测序,此时需要采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase搭配UDG酶进行防污染的高保真扩增。UDG 酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解,并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增,从而保证扩增结果的特异性,准确性。

 

 

基于尿嘧啶切除的克隆

  

基于尿嘧啶切除的克隆依赖于含有重叠序列的PCR产物进行无缝组装,不需要依赖限制性内切酶和连接酶,可用于多个PCR片段的组装、核苷酸序列的修改以及定向克隆。具体操作流程为:

 

 01 

PCR引物5′端具有重叠序列,包含一个dU碱基,该碱基在与5′末端6- 10 nt距离处取代dT;

02 

通过使用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase进行PCR,在目标DNA分子和克隆载体之间生成6-10个碱基的同源性片段,并且每个PCR产物的5'端被引入了一个dU;

03 

使用Uracil-Specific Excision Reagent处理PCR片段,在每个dU位置形成单核苷酸缺口,产生适合于PCR片段定向组装的3´单链延伸;

04 

退火延伸完成组装。

 

以上这些应用展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase在分子生物学研究中的多功能性和高效性,使其成为实验室中不可或缺的工具之一。

 

Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase不仅应用领域广,而且性能优异,图5中展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留。

 

图5.Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留

 

 

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产品名称

产品货号

产品应用

Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase mix Hieff Canace®耐U+高保真DNA聚合酶混合液

12928ES

耐U高保真扩增

热敏UDG含甘油Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile,1 U/μL

10303ES

PCR防污染

Uracil-Specific Excision Reagent (1 U/μL)

14537ES

基于尿嘧啶切除的克隆

 

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