rhPCR:增加RNase HII和可切割引物,比普通PCR更准确、灵敏!-技术前沿-资讯-生物在线

rhPCR:增加RNase HII和可切割引物,比普通PCR更准确、灵敏!

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-11-29T00:00 (访问量:12245)

什么是rhPCR?

rhPCR(RNase H-dependent PCR)即依赖于RNase HII的PCR,在PCR的基础上增加了RNase HII和封闭式可切割rhPCR引物。rhPCR利用了RNase HII的特殊性质,即可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA,但不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键,不能消化单链或双链DNA或RNA。因此只有当互补靶DNA碱基存在时,RNase HII才能消化DNA-RNA杂交链从而允许引物延伸。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生rhPCR引物的裂解切割,故极大地提高了反应的准确性。rhPCR因其特异性和灵敏度,在单核苷酸多态性(SNP)、基因分型、多靶标同时检测、环境核酸检测等方面具有一定的优势。

 

技术路线

01

引物设计

引物设计要确保切割后熔化温度高于退火温度,以保证引物在PCR循环中稳定结合模板,rhPCR引物由3个部分构成

1) 5' DNA片段:在长度和熔化温度(Tm)要求上与标准PCR引物相当,经过RNase HII酶的切割后,能够与模板DNA有效配对并进行延伸。

2) 单个RNA碱基,为RNase-HII提供切割位点。

3) 3' DNA片段:带有一个阻断剂的四或五个碱基长度,通常是一个短的,不可延伸的分子,例如丙二醇,可以阻止DNA聚合酶的延伸,直到该阻断被移除。

 

02

切割与延伸

在rhPCR反应开始时,引物和模板DNA是游离的。当引物与特定的RNA:DNA异源双链模板结合后,封闭引物的RNA 碱基5'-侧被RNase HⅡ酶识别并切割,留下一个带有3'-羟基的DNA寡核苷酸,为DNA聚合酶提供延伸的起点。

图1. rhPCR原理图[1]

 

翌圣RNase HⅡ

翌圣的RNase HⅡ(Cat#14539)来源于深渊热球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.),无核酸外切酶、切口酶、RNase残留,低宿主残留,有效减少体系假阳性。翌圣RNase HⅡ极度耐热,95°C反应30 min后,仍保持活性,可与rhPCR各反应体系兼容,也适用于LAMP等。

 

01

E. coli基因组DNA残留< 0.5 copies/100 U

对不同批次的RNase HⅡ进行E. coli基因组DNA残留检测,结果显示翌圣RNase HⅡ宿主基因组DNA残留远低于0.5 copies/100 U。

图2. E. coli基因组DNA残留检测

 

02

95℃耐热性测试

对翌圣RNase HⅡ进行95℃加热0~45 min后,测试RNase HⅡ的酶活结果,结果表明翌圣RNase HⅡ加热45 min后,酶活几乎没有损失。

图3. 95℃耐热测试

 

03

无核酸外切酶、切口酶、RNase残留(1 U投入量)

将1 U 不同批次的RNase HⅡ分别与相应的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,RNase HⅡ无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。

图4. 核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

 

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产品应用

产品名称

产品货号

rhPCR、LAMP

RNase HII(2 U/μL)

14539ES

rhPCR

Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL

10726ES

RT-LAMP

Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)

14402ES

Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶

11111ES

 

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