CRISPR-Cas9基因编辑系统，图片来自于McGovern Institute for Brain Research at MIT

2020年10月，Jennifer A. Doudna（加州大学伯克利分校）和Emmanuelle Charpentier（马克斯普朗克研究所）因 “开发了一种基因组编辑技术”共同荣获诺贝尔化学奖。

自此，CRISPR基因编辑技术，这一名副其实的“基因剪刀手”技术，通过对目标基因DN**段进行删除、替换、插入、定点突变等“精确编辑”操作，以获得新的功能或表型，甚至创造新的物种，成为了风靡全球生命科学领域实验室的宠儿，被广泛应用于大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇等动植物（细胞）及细菌等微生物的基因组靶向改造，并已在功能基因组研究、疾病防治、动植物育种、动物疾病模型开发、基因治疗等领域展现出巨大的应用前景。

正如《自然》杂志2021年10大科学新闻的介绍中所说：“CRISPR基因编辑技术自问世以来，一直被视为治疗疾病的规则改变者。但是，要使这个梦想成为现实，许多疾病将需要研究人员成功地将CRISPR-Cas9植入人体，并证明它安全有效地编辑了唯一的目标基因。”

01、斑马鱼与CRISPR基因编辑技术

2013年2月，CRISPR/Cas9技术被成功应用于斑马鱼；2015年，来自美国NIH的研究人员进行了一项研究，他们利用CRISPR-CAS9技术靶向斑马鱼特定DNA序列进行基因功能探索和人类治病基因的发现研究，相关研究成果在线发表在国际学术期刊Genome Research。（doi:10.1101/gr.186379.114）

在这项研究中，研究人员发现利用基因编辑技术CRISPR-CAS9进行斑马鱼基因靶向识别以及插入删除特定基因的效率可以达到其他技术的6倍。同时，利用CRISPR-CAS9技术还能够在同一时间对多个基因进行靶向突变，为研究基因功能提供了极大便利。

CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)技术能快速、简便、准确地实现基因组敲除等编辑功能，因而，成为了一种对微生物、动植物以及人类基因组进行基因筛选、修饰的强有力工具。

CRISPR-Cas9 在全基因组筛选中，不仅可以靶向蛋白质编码区域，还可以靶向基因调控区域；不仅可以靶向DNA，还可以靶向microRNA、lncRNA 等 RNA序列等。在医疗保健领域，CRISPR-Cas9基因编辑为治愈遗传病、癌症，乃至心脏病等重大疾病带来了前所未有的希望。

斑马鱼，作为一种已完成基因测序的模式生物，其与人类基因同源性高达87%，且具有饲养成本低、产卵量大、发育周期短、透明易观察等优点，在进行高通量筛选、基因编辑时具有其他动物不可比拟的优势。

复杂的基因编辑加上实时高分辨率成像，可以前所未有的分子细节和分辨率对疾病发展过程进行捕捉以及疾病的建模。

至关重要的是，对斑马鱼进行精确的基因编辑，可以生成人类疾病等位基因的模型，在斑马鱼身上建模的疾病通常代表了人类疾病的真实模型，捕捉了疾病的病因学、进展和解决过程，广泛应用于各种癌症、遗传病、肝脏疾病、心脑血管疾病、血液疾病、心脏病、行为障碍、中枢神经系统疾病等等。

通过斑马鱼CRISPR基因编辑技术，不仅可以用来评价人类基因的作用与功能、解析其在遗传与发育上发挥作用的分子机制，而且可以通过基因组改造（基因敲除、敲入和转基因等）构建先天性心脏病、慢性心衰、扩张型心肌病、癌症等各种人类疾病的斑马鱼模型，表型模拟人类疾病的病症，通过高通量药物筛选技术，用于筛选和发现相关的治疗靶点药物和化合物，研究分子遗传病的病理机制、确认疾病的致病基因、开发基因治疗的生物药等生物医药的研发，从而助力人类健康医学的研究与实验新发现。

02、环特生物的基因编辑技术服务

环特生物提供各种斑马鱼CRISPR基因敲入、敲除、定制转基因技术服务以及斑马鱼疾病模型开发等相关服务，助力基因功能研究。国际**的斑马鱼基因敲入技术与基因置换技术，为您利用斑马鱼遗传模型铺平道路，与您携手推动生物科学和人类健康事业发展！

基因敲除技术

定义：根据给定GeneID或Gene name，分析基因保守结构域，在保守结构域或客户指定区域设计靶点并制备靶点gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因产生移码突变，通过PCR筛选得到稳定遗传品系。

技术特点：

通过将基因敲除斑马鱼品系与野生型相比较，研究者可以揭示特定基因的功能；

在基因组水平上将目标基因敲除，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。

服务流程：

▲根据客户提供的GeneID或Gene name进行基因分析；

▲cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成；

▲高效gRNA靶点的筛选及效率验证；

▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选；

▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定。

定制转基因斑马鱼

定义：斑马鱼转基因技术包括显微注射、电穿孔技术（电脉冲介导）、精子载体法、GAL4/UAS 转录激活系统、Tol2转座子介导、拟型反转录病毒介导、重组杆状病毒介导等方法。

技术目的：

通过定点敲除技术进行基因鉴定和功能研究；

利用报告基因对受体等蛋白质进行功能研究；

构建各种斑马鱼突变体，通过斑马鱼疾病模型进行人类疾病研究和药物筛选；

构建含有特异性启动子的生物感应器，用于环境监测。

技术优点：

Tol2转座子可携带大片段DNA；

Tol2转座子没有位置偏好性，几乎能整合到染色体的任意位置；

Tol2转座子的耐受范围很广；

Tol2作为天然的具有自主转座活性的脊椎动物转座子，能够在胚胎发育的不同时期进行有效的转移；

Tol2转座子介导的转基因技术能够有效克服外源基因在后代传递频率低的技术难题。

服务流程：

▲客户提出转基因品系制备需求；

▲分析可行性；

▲构建载体；

▲斑马鱼胚胎注射；

▲founder筛选；

▲F1代斑马鱼养殖；

▲F2代斑马鱼养殖。

基因敲入技术

定义：非同源依赖的DNA修复技术，在斑马鱼基因组定点插入外源DN**段（荧光蛋白、PA等）。

技术特点：定点插入。

服务流程：

▲根据客户基因敲入要求进行基因分析；

▲cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成；

▲高效gRNA靶点的筛选及效率验证；

▲敲入载体设计及构建；

▲斑马鱼胚胎的显微注射和敲入验证；

▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选；

▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定。

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